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              T4 DNA Ligase

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        FM01135000U95元
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        T4 DNA Ligase

        T4 DNA Ligase
         
         
         
         
         
        包装内容
        100次
        Cat:FP015
        500次
        Cat:FP010
        T4 DNA Ligase(350 U/μl)
        35,000 Units
        35,000 UnitsX5
        10×T4 DNA Ligase Buffer
        1 ml
        1ml X5
         
        贮存条件:
        -20℃保存
         
        产品简介     
        该酶催化相邻DNA链的5’-P末端和3’-OH末端以磷酸二酯键结合的反应,需ATP作辅酶。本酶不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的DNA的连接,也可以催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接,修复双链DNA、RNA、DNA/RNA杂交链中的单链切口
         
        起源
        Escherichia coli carrying the plasmid that enable highly expression of T4 DNA Ligase gene
         
        酶贮存溶液:
        10 mM Tris-HCl (pH 7.5),
        0.1 mM EDTA,
        50 mM KCl,
        1 mM DTT,
        50% Glycerol
        and 200 μg/ml Nuclease free BSA.
         
        活性定义
        在20 μl的连接反应体系中,6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时,有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。
        本酶的1 U相当于ATP-PPi交换反应中0.008 Weiss Unit。    
         
         
         
         
        1) 2,000 U的本酶和1 μg的λ-Hind III片段在37℃下反应24小时,DNA的电泳谱带不发生变化。
        2) 2,000 U的本酶和1 μg的Supercoiled pBR322 DNA在37℃下反应24小时,DNA的电泳谱带不发生变化。
        3) 2,000 U的本酶和1 μg的16S,23S rRNA在37℃下反应24小时,RNA
         
        1)DNA片段和载体DNA的连接。
        2)DNA片段和Linker或Adaptor DNA的连接。
         
        使用注意
        连接反应因末端碱基顺序的不同而反应速度各异,一般有下列倾向:
        突出末端:Hind III>Pst I>EcoR I>BamH I>Sal I
        平滑末端:Hae III>Alu I>Hinc II>Sma I
        EcoR V>Sca I>Pvu II>Nru I
        其中连接Hind III末端的速度约为连接Sal I末端速度的10~40倍;
        而连接Hae III末端的速度约为连接Sma I末端速度的5~10倍。
         
        附带10×Buffer组成(保存:-20℃)
        10×T4 DNA Ligase Buffer
        Tris-HCl(pH 7.6) 660 mM
        MgCl 66 mM
        DTT 100 mM
        ATP 1 mM
        * Buffer在融解时,如果出现少量沉淀属正常现象,请于37℃保温溶解后使用
        使用举例
        DNA片段和载体DNA的连接
        1. 在微量离心管中制备下列连接反应液。
        10×T4 DNA Ligase Buffer          2.5 μl
        DNA片段*                       约0.3 pmol
        载体DNA**                     约0.03 pmol
        T4 DNA Ligase                    1 μl
        dH2O                         up to 25 μl
        * DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3~10倍。
        ** 平滑末端的载体与DNA片段进行连接时,应首先将载体进行去
        磷酸化处理,以防止其自身环化。
        2. 16℃过夜反应。
        3. 加入2.5 μl(1/10量)的3 M CH3COONa(pH5.2)。
        4. 加入62.5 μl(2.5倍量)的冷无水乙醇,-20℃放置30~60分钟。
        5. 离心回收沉淀,用70%的冷乙醇清洗沉淀,真空干燥。
        6. 25~50 μl TE溶解,10~20 μl转化至100 μl的感受态细胞中。
         
         
         
         
         
         
         
         
         
         
         
         
         

           
         

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